「비료의 품질검사방법 및 시료채취기준」중 일부개정

1. 개정 이유

가. 상토에서 병원성미생물인 리스테리아모노사이토제스(Listeria monocytogenes)가 검출됨에 따른 공정분석법 설정

나. 불분명한 분석법 등을 명확히 하여 투명성 제고 및 신뢰성 확보

2. 주요 내용

가. 병원성미생물인 리스테리아모노사이토제스(Listeria monocytogenes) 공정분석법 설정 (별표1)

나. 리신 검사방법 개정 (별표1)

○ 리신 단백질 순도를 높이기 위해 단백질체 분석 시료 전처리 방법  등 변경

○ 분석시간 단축을 위한 UPLC 운용 조건 변경

○ 활성형 리신단백질 정량법 추가 등

다. 이물질 공정분석법 설정 (별표1)

라. 염소와 염분(염화물) 공정분석법 개정 (별표1)

마. 재검토기한 규정 부칙이 아닌 본문에 설정 (제13조)

3. 참고 사항

가. 관계법령(입안근거): 「비료관리법」 제18조제2항 및 제26조, 같은 법 시행령 제10조제2항 및 제19조제2항

나. 예산조치: 별도조치 필요 없음.

다. 기타: 개정안 및 신․구조문 대비표

◎ 농촌진흥청 고시 제2019-11호

「비료관리법」제18조제2항 및 제26조, 같은 법 시행령 제10조제2항 및 제19조제2항에 따른 「비료의 품질검사방법 및 시료채취기준」을 다음과 같이 개정 고시합니다.

2019년 3월 28일

농 촌 진 흥 청 장

「비료의 품질검사방법 및 시료채취기준」중 일부개정

제13조를 다음과 같이 신설한다.

제13조 (재검토기한) 농촌진흥청장은 이 고시에 대하여 「훈령·예규 등의 발령 및 관리에 관한 규정」에 따라 2019년 6월 1일 기준으로 매3년이 되는 시점(매 3년째의 5월 31일까지를 말한다)마다 그 타당성을 검토하여 개선 등의 조치를 하여야 한다.

부  칙 <2019. 3. 28.>

제1조 (시행일) 이 고시는 고시한 날부터 시행한다.

[별표 1]을 다음과 같이 개정한다.

목차 Ⅲ. 유해성분에 “16. 리스테리아모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)”을 신설한다.

목차 Ⅳ. 기타성분에 “20. 이물질(유리, 플라스틱, 금속, 뼈, 도자기, 타일, 비닐, 천, 은박, 종이 등 이와 유사한 물질을 말한다.)”을 신설한다.

Ⅲ. 유해성분 15. 리신(Ricin) 다.3).다)의 “(3) 윗부분의 Stacking gel은 젤 나이프를 이용해 제거하고 gel이 잠기도록 Coomassie Blue에 담가 12시간 shaker위에 교반시킨다. 5시간 후, destaining buffer에 옮겨 배경색의 푸른색이 다 빠질 때까지 충분히 교반한다.”를 “(3) 윗부분의 Stacking gel은 젤 나이프를 이용해 제거하고 gel이 잠기도록 Coomassie Blue에 담가 12시간 shaker위에 교반시킨다.

(4) Destaining buffer에 옮겨 배경색의 푸른색이 다 빠질 때까지 충분히 교반한다.”로 한다.

Ⅲ. 유해성분 15. 리신(Ricin) 라.2)의 “바) nanoACUITY BEH300 C18 column (Waters, 4453793)”를 “바) TRIZAIC nanoTile 1.7 um, C18 (Waters, 186003763)”로 한다.

Ⅲ. 유해성분 15. 리신(Ricin) 라.3).가)의 “(3) 시료가 포함된 젤을 물(HPLC grade) 1㎖을 첨가하고 1일 동안 반복하여 교체하면서 잔여 세척을 실시한다. (4) 50% ACN (v/v), 50 mM ammonium bicarbonate 순서대로 1 ㎖을 첨가하고 각각 1일 동안 반복하여 교체하면서 잔여 세척을 실시한다.”를 “(3) 시료가 포함된 젤을 30% Methanol 200μL으로 세척한 후 1x1 mm2으로 자른다. (4) 시료가 포함된 젤을 물(HPLC grade) 1㎖을 첨가하고 1일 동안 반복하여 교체하면서 잔여 세척을 실시한다. (5) 50% ACN (v/v), 50 mM ammonium bicarbonate(in 50% Acetonitrile) 순서대로 1 ㎖을 첨가하고 각 각 1일 동안 반복하여 교체하면서 잔여 세척을 실시한다.”로 한다.

Ⅲ. 유해성분 15. 리신(Ricin) 라.3).나)의 “(2) 1 M dithiothreitol, 5 ㎕를 첨가하고 잘 섞는다. (3) 미리 55℃로 설정해 놓은 heat block에 튜브를 장착하고 30분 동안 반응을 진행한다.”를 “(2) 10 mM dithiothreitol (in 50mM ammonium bicarbonate), 50 ㎕를 첨가하고 잘 섞는다. (3) 56 ℃로 설정해 놓은 heat block에 튜브를 장착하고,  2시간 동안 반응을 진행한다.  (4) 100% ACN으로 세척 후 50 mM ammonium bicarbonate (in 50% Acetonitrile) 으로 1일간 세척 후 sped vac.으로 완전히 건조시킨다.”로 한다.

Ⅲ. 유해성분 15. 리신(Ricin) 라.3).다)의 “(1) 이황화 결합 환원 반응을 마친 시료에 1 M iodoacetamide, 5 ㎕를 첨가한다. (2) 상온에서 차광한 상태로 30분 동안 반응을 진행한다. (3) Carbamidomethylation 반응을 진행한 시료를 e-tube에 옮겨 담고 sped vac.으로 완전히 건조시킨다.”를 “(1) 건조한 시료에 20 mM iodoacetamide (in 50mM ammonium bicarbonate), 50 ㎕와 50mM ammonium bicarbonate 50 ㎕를 첨가한다.  (2) 상온에서 차광한 상태로 30분 동안 반응을 진행한다. (3) Carbamidomethylation 반응을 진행한 시료를 100% Acetonitrile 으로 세척 후 50mM ammonium bicarbonate(in 50% Acetonitrile)으로 1일간 세척한다. (4) 100% Acetonitrile으로 세척 후 sped vac.으로 완전히 건조시킨다.”로 한다.

Ⅲ. 유해성분 15. 리신(Ricin) 라.3).라)의 “(5) 건조된 시료를 80℃로 설정해 놓은 heat block에 장착하고 30분 동안 반응하여 ammonium bicarbonate의 decomposition을 진행한다.”를 “(5) 건조된 시료를 80℃로 설정해 놓은 heat block에 뚜껑을 열어 장착하고 30분 동안 반응하여 ammonium bicarbonate의 decomposition을 진행한다.”로 한다.

Ⅲ. 유해성분 15. 리신(Ricin) 라.3).바)의 “(1) Tryptic digestion을 수행한 시료에 대해 ESI-Q-TOF MS/MS 분석을 실시한다.

이때의 조건은 다음과 같다.

• nano UPLC 운용조건

- Column: nanoAcquity BEH300 C18, 1.7 μm × 150mm

- Temperature: 40℃

- Mobile Phase:

· mobile phase A: 0.1% v/v Formic acid

· mobile phase B: 0.1% v/v Formic acid, Acetonitrile

	Time (min)	A(% v/v)	B(% v/v)
1	Initial	97.0	3.0
2	3	90.0	10.0
3	150	65.0	35.0
4	160	20.0	80.0
5	170	97.0	3.0
6	180	97.0	3.0

- Flow rate: 250 nL/min Injection volume: 2.5 ㎕

• ESI-Q-TOF MS/MS 운용조건

- System: Synapt G2-Si HDMS (Waters, UK)

- Source: NanoLockSpray Exact Mass ionization source Positive

- Ms Source parameters

· Capillary (kV): 3.0

· Cone voltage (V): 30

· Source Temperature (℃): 120

· Scan Time(sec): 0.5”를 “(1) Tryptic digestion을 수행한 시료에 대해 ESI-Q-TOF MS/MS 분석을 실시한다.

이때의 조건은 다음과 같다.

• nano UPLC 운용조건

- Column: TRIZAIC nanoTile 1.7 um, C18

- Temperature: 40℃

- Mobile Phase:

· mobile phase A: 0.1% v/v Formic acid

· mobile phase B: 0.1% v/v Formic acid, Acetonitrile

	Time (min)	A(% v/v)	B(% v/v)
1	Initial	97.0	3.0
2	3	90.0	10.0
3	40	65.0	35.0
4	47	20.0	80.0
5	50	97.0	3.0
6	60	97.0	3.0

- Flow rate: 250 nL/min Injection volume: 2.5 ㎕

• ESI-Q-TOF MS/MS 운용조건

- System: Synapt G2-Si HDMS (Waters, UK)

- Source: TRIZAIC Exact Mass ionization source Positive

- Ms Source parameters

· Capillary (kV): 3.0

· Cone voltage (V): 30

· Source Temperature (℃): 120

· Scan Time(sec): 0.5”로 한다.

Ⅲ. 유해성분 15. 리신(Ricin) 라.3).사)의 “(1) ESI-Q-TOF MS/MS 분석을 통하여 얻어진 결과는 ProteinLynx Global Server (PLGS) version 3.0을 이용하여 단백질 동정 및 절대정량을 실시하였다. 단백질 동정은 SwissProt 데이터베이스 를 이용하여 실시하였으며, 절대정량은 표준품 BSA (SwissProt P02769)의 질량값 정보를 바탕으로 Waters에서 제시하는 방법(1) 및 2005년 Silva J. 등이 발표한 논문을 토대로 수행하였다(2)”를 “(1) ESI-Q-TOF MS/MS 분석을 통하여 얻어진 결과는 ProteinLynx Global Server (PLGS) version 3.0을 이용하여 단백질 동정 및 절대정량을 실시하였다. 단백질 동정은 SwissProt 데이터베이스 를 이용하여 실시하였으며, 절대정량은 표준품 GPB (SwissProt P00489)의 질량값 정보를 바탕으로 Waters에서 제시하는 방법(1) 및 2005년 Silva J. 등이 발표한 논문을 토대로 수행하였다(2) ※ (1) Waters, Hi3 Standards Care and Use Manual, (2) Silva, J. et. al. Mol. Cell. Proteomics, 2006, 144-156. (2) 리신 계산방법 (가) 리신단백질 Type 2(RIP 2)에서 서브유닛 A와 서브유닛 B의 함량 중 가장 적은 함량을 리신함량으로 본다. 다만, 서브유닛 A 또는 B만 분석된 경우에는 불검출로 본다. ※ 리신단백질은 RIP (Ribosome- Inactivating Protein)으로 두 가지 형태가 존재한다. Type 1 (RIP 1)은 서브유닛 A만 존재하여 독성이 없으며, Type 2(RIP 2) 는 서브유닛 A와 서브유닛 B가 결합을 이루고 있어 독성이 있음”로 한다.

Ⅲ. 유해성분 15. 리신(Ricin) 마.5)의 “나) 전기영동된 젤은 손상되지 않도록 주의하여 젤을 분리한 후, trasfer장치에 스펀지, 3M paper, 분리해 낸 젤, PVDF, 3M paper, 스펀지를 순서대로 쌓은 후 transfer device에 장착하고 4도시 조건에서 12V 전압으로 O/N 조건으로 transfer를 수행한다.”를 “나) 전기영동된 젤은 손상되지 않도록 주의하여 젤을 분리한 후, trasfer장치에 스펀지, 3M paper, 분리해 낸 젤, PVDF, 3M paper, 스펀지를 순서대로 쌓은 후 transfer device에 장착하고 4℃ 조건에서 12V 전압으로 O/N 조건으로 transfer를 수행한다.”로 한다.

Ⅲ. 유해성분에 “16. 리스테리아모노사이토제스(Listeria monocytogenes)”을 다음과 같이 신설한다.

“16. 리스테리아모노사이토제스(Listeria monocytogenes)

가. 배지의 조제

1) Listeria 증균배지(Listeria Enrichment Broth)

Tryptone                            17 g

Soytone                              3 g

Glucose                             2.5 g

Sodium Chloride                      5 g

Dipotassium Phosphate              2.5 g

Yeast Extract                        6 g

Cycloheximide                     0.05 g

Acriflavin HCl                    0.015 g

Nalidixic Acid                     0.04 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 7.3±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

2) Oxford 한천배지(Oxford Agar)

Columbia blood agar base            39 g

Esculin                               1 g

Ferric ammonium citrate             0.5 g

Lithium chloride                      15 g

Agar                                 2 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 7.0±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균하고 50℃정도로 식힌 후 다음의 Supplement를 차례로 여과멸균하여 가한다.

Supplement ; Cycloheximide 0.4 g, Colistin Sulfate 0.02 g,  Acriflavin 0.005 g, Cefotetan 0.002 g, Fosfomycin 0.01 g

3) PALCAM 한천배지(Polymyxin Acriflavin LiCl Ceftazidime Esculin Mannitol Agar)

Peptone	23 g

Mannitol	10 g

Sodium Chloride	5 g

Starch	1 g

Ferric Aammouium Citrate	0.5 g

Esculin	0.8 g

Dextrose	0.5 g

Lithium Chloride	15.0 g

Phenol Red	0.08 g

Agar	13 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹이고 pH 7.2±0.2 로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다. 이를 50℃로 식히고 다음의 Supplement를 차례로 여과멸균하여 가한다.

Supplement : Polymyxin B sulfate 0.01 g, Acriflavin 0.005 g, Ceftazidime 0.02 g

4) Tryptic Soy 한천배지(Tryptic Soy Agar)

Tryptose	17 g

Soytone	3 g

Glucose	2.5 g

Sodium Chloride	5 g

Dipotassium Phosphate	2.5 g

Agar	15 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 7.3±0.2로 조정 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

나. 증균배양

농산물 및 농자재에 대해서는 증균배지로 Listeria 증균배지(배지 1)를 사용하며, 검체 25 g(mL)를 취하여 225 mL의 Listeria 증균배지를 가한 후 30℃에서 24∼48시간 배양한다. 이후, 배양액 0.1 ml을 10ml의 Fraser broth에 접종하여 35∼37℃에서 24∼48시간 2차 증균을 실시한다.

다. 분리배양

증균배양액을 Oxford 한천배지(배지 2) 또는 PALCAM 한천배지(배지 3)에 접종하여 35〜37℃에서 24∼48시간 배양한다. 의심집락이 확인되면 이를 0.6% yeast extract가 포함된 Tryptic soy 한천배지(배지 4)에 접종하여 30℃에서 24∼48시간 배양한다.

라. 확인시험

그람염색 후 그람양성 간균이 확인되면 hemolysis, motility, catalase, CAMP test와 mannitol, rhamnose, xylose의 당분해시험을 실시한다. 이 결과 β-hemolysis를 나타내고 catalase 양성, motility 양성을 나타내며 CAMP test결과 Staphylococcus aureus(ATCC 25923)에서 양성, Rhodococcus equi(ATCC 6939)에서 음성으로 나타나는 동시에 당분해시험 결과 mannitol 비분해, rhamnose 분해, xylose 비분해의 결과를 보일 경우 Listeria monocytogenes 양성으로 판정한다.

또한 확인시험시 각종 생화학시험은 국제적으로 공인된 키트(kit) 또는 장비를 이용할 수 있다. 필요한 경우 혈청형 확인시험, 독소 유전자 확인시험, 유전체 상동성 분석시험을 추가할 수 있다.”

Ⅳ. 기타성분 3. 염소와 염분(염화물) 나.를 아래와 같이 신설한다. “나. Ion chromatography 법

1) 적용범위

이 분석법은 이온크로마토그래프(IC)를 이용하여 부산물비료 중의 염소를 0.2μm 막여과지에 통과시켜 고체 미립자를 제거한 후 음이온 교환 컬럼을 통과시켜 전기전도도 검출기로 정량 분석 하는데 적용 한다.

2) 분석기기 및 기구

가) 검출기 : 전기전도도 검출기, 전기화학적 검출기 등

나) 분리컬럼 : 유리 또는 에폭시 수지로 이온교환체를 충진시킨 것

다) 펌프 : 150kg/cm2 ∼ 350kg/cm2 고압 압력 펌프

3) 시약의 조제

가) 표준원액: IC용 1,000mg/L: Cl-을 포함한 음이온 표준액

나) 용리액(Eluant) : 3.2mM Na2CO3 + 1mM NaHCO3 / 1L H2O

다) Suppressor Regenerant Reagent :　98% 이상의 H2SO4 용액을 3mL 정확히 취하여 1L에 정제수를 넣어 표선을 채운다.

라) 탈이온수 (이온교환수지로 탈염 정제한 물)

4) 공시액 조제

가) 공시품 일정량을 250mL 용량플라스크에 정확히 취하고 150mL 물을 가하여 수평진탕기(100회/분, 진폭 10cm 또는 190회/분, 진폭 5 cm)를 사용하여 30분간 진탕한 다음 거름종이 5B 또는 이와 동등한 여지를 사용하여 여과한다.

나) 여액을 0.45㎛ 이하의syringe filter 를 사용하여 10mL vial 에 옮겨 담는다.

5) 정량

가) 검량선의 작성

(1) 탈이온수에 염소이온 표준원액 (1,000mg/L) 0.1mL, 0.2mL, 0.5mL, 1.0mL,  2.0mL를 정확히 취하여 100mL 용량플라스크에 넣고 물을 넣어 표선을 채워 다음과 같이 준비한다.

검량선	표준물질	표준물질 주입량	최종농도
STD.1	1,000 mg/L	0.1 mL	1.0 mg/L
STD.2	1,000 mg/L	0.2 mL	2.0 mg/L
STD.3	1,000 mg/L	0.5 mL	5.0 mg/L
STD.4	1,000 mg/L	1.0 mL	10.0 mg/L
STD.5	1,000 mg/L	2.0 mL	20.0 mg/L

(2) 이온크로마토그래프룰 작동시켜 유속을 0.7 mL/min 압력은 6～8MP, 전기전도도는 1~5uS/cm 으로 고정시킨 다음 용리액 및 재생액을 흘러 보내면서 펌프의 압력 및 검출기의 전도도가 일정하게 유지될 때까지 기다린다.

(3) 기기가 안정화되면 각각의 검량선 작성용 표준액을 주입하여 크로마토그램을 작성하고 각 음이온의 농도와 크로마토그램상의 봉우리높이 또는 면적에 대한 검량선을 작성한다.

나) 시료분석

검량선 작성 시와 같은 기기조건하에서 이온크로마토그래프에 주입하여 크로마토그램을 측정하고 미리 작성한 검량선으로부터 시료의 농도(mg/L)를 산출하며 정도보증 및 정도관리는 표1에 따른다.

(부 기)

용리액의 조성 및 농도는 기기제조 회사 또는 분리 컬럼의 종류 등에 따라 달라질 수 있으므로 사용기기에 대한 설명서를 참조한다.

표1. 정도관리 목표 값

정도관리 항목	정도관리 목표
정량한계 검정곡선 정밀도 정확도	0.1 mg/L 결정계수(R2) 0.98 이상 또는 감응계수(RF)의 상대표준편차 ≤ 20 % 상대표준편차가 ± 25 % 이내 75 ∼ 125 %

”

Ⅲ. 유해성분에 “20. 이물질”을 다음과 같이 신설한다.

“20. 이물질

가. 이물질: 유리, 플라스틱, 금속, 뼈, 도자기, 타일, 비닐, 천, 은박, 종이 등 이와 유사한 물질

나. 검사방법

1) 비료 약 100g 이상을 잘 혼합한 후 펼쳐서 60℃(±1℃)에서 약 24시간 건조시킨 후 비료의 무게를 측정한다(A).

2) 건조된 비료에서 2mm를 초과하는 이물질을 125mm～2mm의 표준체를 사용하여 선별한다.

※ 비료 중 응집되어 있는 덩어리는 2mm 표준체에서 흐르는 물로 씻어 주면서 부드러운 솔로 약 5분간 가볍게 쓸어서 풀어준다. 다만, 선별과정 또는 덩어리를 푸는 과정에서 이물질이 파쇄가 되지 않아야 한다.

※ 표준체는 별표1. Ⅱ. 주성분. 5. 분말도측정법의 시험용 체의 규격표에 있는 것을 말한다.

3) 선별한 이물질을 물로 세척한 후 60℃(±1℃)에서 약 24시간 건조시킨 후 이물질의 무게를 측정한다(B)

다. 계산방법

이물질 (%) =	건조 후 이물질무게(B)	×100
	건조 후 비료무게(A)

라. 판정기준

「비료 공정규격설정 및 지정」(농진청 고시) 제6조제1항제9호에 따른다.”

신·구조문대비표

[「비료의 품질검사방법 및 시료채취기준」중 일부개정(안)]

현행

개정

<신설>

제13조 (재검토기한) 농촌진흥청장은 이 고시에 대하여 「훈령·예규 등의 발령 및 관리에 관한 규정」에 따라 2019년 6월 1일 기준으로 매3년이 되는 시점(매 3년째의 5월 31일까지를 말한다)마다 그 타당성을 검토하여 개선 등의 조치를 하여야 한다.

부  칙 <2019. 3. 28.>

제1조 (시행일) 이 고시는 고시한 날부터 시행한다.

<별표 1> 비료의 이화학적 검사방법 등

목 차

Ⅰ.∼Ⅱ. (생략)

Ⅲ. 유해성분

1.∼15. (생략)

16. <신 설>

Ⅳ.기타성분

1.∼19. (생략)

20. <신 설>

<별표 1> 비료의 이화학적 검사방법 등

목 차

Ⅰ.∼Ⅱ. (현행과 같음)

Ⅲ. 유해성분

1.∼15. (현행과 같음)

16. 리스테리아모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)

Ⅳ.기타성분

1.∼19. (현행과 같음)

20. 이물질(유리, 플라스틱, 금속, 뼈, 도자기, 타일, 비닐, 천, 은박, 종이 등 이와 유사한 물질을 말한다.)

Ⅲ. 유해성분

15. 리신(Ricin)

가.〜나.(생략)

다. SDS-PAGE (단백질 전기영동) 시험법

1)〜2) (생략)

3) 실험 방법

가)〜나) (생략)

다) SDS-PAGE gel 염색 및 탈색

(1)〜(2) (생략)

(3) 윗부분의 Stacking gel은 젤 나이프를 이용해 제거하고 gel이 잠기도록 Coomassie Blue에 담가 12시간 shaker위에 교반시킨다. 5시간 후, destaining buffer에 옮겨 배경색의 푸른색이 다 빠질 때까지 충분히 교반한다.

(4) <신설>

라. 리신 단백질 절대정량 시험법(Quantitative proteomic analysis)

1) (생략)

2) 필요 기구 및 장치

가)〜마) (생략)

바) nanoACUITY BEH300 C18 column (Waters, 4453793)

사) (생략)

3) 실험 방법

가) 단백질체 분석 시료 전처리

(1)〜(2) (생략)

(3) 시료가 포함된 젤을 물(HPLC grade) 1㎖을 첨가하고 1일 동안 반복하여 교체하면서 잔여 세척을 실시한다.

(4) 50% ACN (v/v), 50 mM ammonium bicarbonate 순서대로 1 ㎖을 첨가하고 각각 1일 동안 반복하여 교체하면서 잔여 세척을 실시한다.

(5) <신설>

Ⅲ. 유해성분

15. 리신(Ricin)

가.〜나.(현행과 같음)

다. SDS-PAGE (단백질 전기영동) 시험법

1)〜2) (현행과 같음)

3) 실험 방법

가)〜나) (현행과 같음)

다) SDS-PAGE gel 염색 및 탈색

(1)〜(2) (현행과 같음)

(3) 윗부분의 Stacking gel은 젤 나이프를 이용해 제거하고 gel이 잠기도록 Coomassie Blue에 담가 12시간 shaker위에 교반시킨다.

(4) Destaining buffer에 옮겨 배경색의 푸른색이 다 빠질 때까지 충분히 교반한다.

라. 리신 단백질 절대정량 시험법(Quantitative proteomic analysis)

1) (현행과 같음)

2) 필요 기구 및 장치

가)〜마) (현행과 같음)

바) TRIZAIC nanoTile 1.7 μm, C18 (Waters, 186003763)

사) (현행과 같음)

3) 실험 방법

가) 단백질체 분석 시료 전처리

(1)〜(2) (현행과 같음)

(3) 시료가 포함된 젤을 30% Methanol 200μL으로 세척한 후 1x1 mm2으로 자른다.

(4) 시료가 포함된 젤을 물(HPLC grade) 1㎖을 첨가하고 1일 동안 반복하여 교체하면서 잔여 세척을 실시한다.

(5) 50% ACN (v/v), 50 mM ammonium bicarbonate(in 50% Acetonitrile) 순서대로 1 ㎖을 첨가하고 각 각 1일 동안 반복하여 교체하면서 잔여 세척을 실시한다.

나) 이황화 결합 환원

(1) (생략)

(2) 1 M dithiothreitol, 5 ㎕를 첨가하고 잘 섞는다.

(3) 미리 55℃로 설정해 놓은 heat block에 튜브를 장착하고 30분 동안 반응을 진행한다.

(4) <신설>

나) 이황화 결합 환원

(1) (현행과 같음)

(2) 10 mM dithiothreitol (in 50mM ammonium bicarbonate), 50 ㎕와 50mM ammonium bicarbonate 50 ㎕를 첨가한다.

(3) 56 ℃로 설정해 놓은 heat block에 튜브를 장착하고,  2시간 동안 반응을 진행한다.

(4) 100% ACN으로 세척 후 50 mM ammonium bicarbonate (in 50% Acetonitrile) 으로 1일간 세척 후 sped vac.으로 완전히 건조시킨다.

다) Carbamidomethylation 반응

(1) 이황화 결합 환원 반응을 마친 시료에 1 M iodoacetamide, 5 ㎕를 첨가한다.

(2) 상온에서 차광한 상태로 30분 동안 반응을 진행한다.

(3) Carbamidomethylation 반응을 진행한 시료를 e-tube에 옮겨 담고 sped vac.으로 완전히 건조시킨다.

(4) <신설>

다) Carbamidomethylation 반응

(1) 건조한 시료에 20 mM iodoacetamide (in 50mM ammonium bicarbonate), 50 ㎕와 50mM ammonium bicarbonate 50 ㎕를 첨가한다.

(2) 상온에서 차광한 상태로 30분 동안 반응을 진행한다.

(3) Carbamidomethylation 반응을 진행한 시료를 100% Acetonitrile 으로 세척 후 50mM ammonium bicarbonate(in 50% Acetonitrile)으로 1일간 세척한다.

(4) 100% Acetonitrile으로 세척 후 sped vac.으로 완전히 건조시킨다.

라) Tryptic digestion

(1)〜(4) (생략)

(5) 건조된 시료를 80℃로 설정해 놓은 heat block에 장착하고 30분 동안 반응하여 ammonium bicarbonate의 decomposition을 진행한다.

마) (생략)

바) ESI-Q-TOF MS/MS 분석

(1) Tryptic digestion을 수행한 시료에 대해 ESI-Q-TOF MS/MS 분석을 실시한다.

이때의 조건은 다음과 같다.

• nano UPLC 운용조건

- Column: nanoAcquity BEH300 C18, 1.7 μm × 150mm

- Temperature: 40℃

- Mobile Phase:

· mobile phase A: 0.1% v/v Formic acid

· mobile phase B: 0.1% v/v Formic acid, Acetonitrile

	Time (min)	A(% v/v)	B(% v/v)
1	Initial	97.0	3.0
2	3	90.0	10.0
3	150	65.0	35.0
4	160	20.0	80.0
5	170	97.0	3.0
6	180	97.0	3.0

- Flow rate: 250 nL/min Injection volume: 2.5 ㎕

• ESI-Q-TOF MS/MS 운용조건

- System: Synapt G2-Si HDMS (Waters, UK)

- Source: NanoLockSpray Exact Mass ionization source Positive

- Ms Source parameters

· Capillary (kV): 3.0

· Cone voltage (V): 30

· Source Temperature (℃): 120

· Scan Time(sec): 0.5

사) Absolute Quantification of Protein

(1) ESI-Q-TOF MS/MS 분석을 통하여 얻어진 결과는 ProteinLynx Global Server (PLGS) version 3.0을 이용하여 단백질 동정 및 절대정량을 실시하였다. 단백질 동정은 SwissProt 데이터베이스 를 이용하여 실시하였으며, 절대정량은 표준품 BSA (SwissProt P02769)의 질량값 정보를 바탕으로 Waters에서 제시하는 방법(1) 및 2005년 Silva J. 등이 발표한 논문을 토대로 수행하였다(2)

(2) <신설>

라) Tryptic digestion

(1)〜(4) (현행과 같음)

(5) 건조된 시료를 80℃로 설정해 놓은 heat block에 뚜껑을 열어 장착하고 30분 동안 반응하여 ammonium bicarbonate의 decomposition을 진행한다.

마) (현행과 같음)

바) ESI-Q-TOF MS/MS 분석

(1) Tryptic digestion을 수행한 시료에 대해 ESI-Q-TOF MS/MS 분석을 실시한다.

이때의 조건은 다음과 같다.

• nano UPLC 운용조건

- Column: TRIZAIC nanoTile 1.7 μm, C18

- Temperature: 40℃

- Mobile Phase:

· mobile phase A: 0.1% v/v Formic acid

· mobile phase B: 0.1% v/v Formic acid, Acetonitrile

	Time (min)	A(% v/v)	B(% v/v)
1	Initial	97.0	3.0
2	3	90.0	10.0
3	40	65.0	35.0
4	47	20.0	80.0
5	50	97.0	3.0
6	60	97.0	3.0

- Flow rate: 250 nL/min Injection volume: 2.5 ㎕

• ESI-Q-TOF MS/MS 운용조건

- System: Synapt G2-Si HDMS (Waters, UK)

- Source: TRIZAIC source Positive

- Ms Source parameters

· Capillary (kV): 3.0

· Cone voltage (V): 30

· Source Temperature (℃): 120

· Scan Time(sec): 0.5

사) Absolute Quantification of Protein

(1) ESI-Q-TOF MS/MS 분석을 통하여 얻어진 결과는 ProteinLynx Global Server (PLGS) version 3.0을 이용하여 단백질 동정 및 절대정량을 실시하였다. 단백질 동정은 SwissProt 데이터베이스를 이용하여 실시하였으며, 절대정량은 표준품 GPB (SwissProt P00489)의 질량값 정보를 바탕으로 Waters에서 제시하는 방법(1) 및 2005년 Silva J. 등이 발표한 논문을 토대로 수행하였다(2)

※ (1) Waters, Hi3 Standards Care and Use Manual, (2) Silva, J. et. al. Mol. Cell. Proteomics, 2006, 144-156.

(2) 리신 계산방법

(가) 리신단백질 Type 2(RIP 2)에서 서브유닛 A와 서브유닛 B의 함량 중 가장 적은 함량을 리신함량으로 본다. 다만, 서브유닛 A 또는 B만 분석된 경우에는 불검출로 본다.

※ 리신단백질은 RIP (Ribosome- Inactivating Protein)으로 두 가지 형태가 존재한다. Type 1 (RIP 1)은 서브유닛 A만 존재하여 독성이 없으며, Type 2(RIP 2) 는 서브유닛 A와 서브유닛 B가 결합을 이루고 있어 독성이 있음

마. Western blot 시험법

1)〜4) (생략)

5) Transfer 및 항체 부착

가) (생략)

나) 전기영동된 젤은 손상되지 않도록 주의하여 젤을 분리한 후, trasfer장치에 스펀지, 3M paper, 분리해 낸 젤, PVDF, 3M paper, 스펀지를 순서대로 쌓은 후 transfer device에 장착하고 4도시 조건에서 12V 전압으로 O/N 조건으로 transfer를 수행한다.

다)〜자) (생략)

마. Western blot 시험법

1)〜4) (현행과 동일)

5) Transfer 및 항체 부착

가) (현행과 동일)

나) 전기영동된 젤은 손상되지 않도록 주의하여 젤을 분리한 후, trasfer장치에 스펀지, 3M paper, 분리해 낸 젤, PVDF, 3M paper, 스펀지를 순서대로 쌓은 후 transfer device에 장착하고 4℃ 조건에서 12V 전압으로 O/N 조건으로 transfer를 수행한다.

다)〜자) (현행과 동일)

16. <신 설>

16. 리스테리아모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)

가. 배지의 조제

1) Listeria 증균배지(Listeria Enrichment Broth)

Tryptone                            17 g

Soytone                              3 g

Glucose                            2.5 g

Sodium Chloride                     5 g

Dipotassium Phosphate             2.5 g

Yeast Extract                       6 g

Cycloheximide                    0.05 g

Acriflavin HCl                   0.015 g

Nalidixic Acid                    0.04 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 7.3±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

2) Oxford 한천배지(Oxford Agar)

Columbia blood agar base            39 g

Esculin                               1 g

Ferric ammonium citrate             0.5 g

Lithium chloride                      15 g

Agar                                 2 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 7.0±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균하고 50℃정도로 식힌 후 다음의 Supplement를 차례로 여과멸균하여 가한다.

Supplement ; Cycloheximide 0.4 g, Colistin Sulfate 0.02 g,  Acriflavin 0.005 g, Cefotetan 0.002 g, Fosfomycin 0.01 g

3) PALCAM 한천배지(Polymyxin Acriflavin LiCl Ceftazidime Esculin Mannitol Agar)

Peptone	23 g

Mannitol	10 g

Sodium Chloride	5 g

Starch	1 g

Ferric Aammouium Citrate	0.5 g

Esculin	0.8 g

Dextrose	0.5 g

Lithium Chloride	15.0 g

Phenol Red	0.08 g

Agar	13 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹이고 pH 7.2±0.2 로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다. 이를 50℃로 식히고 다음의 Supplement를 차례로 여과멸균하여 가한다.

Supplement : Polymyxin B sulfate 0.01 g, Acriflavin 0.005 g, Ceftazidime 0.02 g

4) Tryptic Soy 한천배지(Tryptic Soy Agar)

Tryptose	17 g

Soytone	3 g

Glucose	2.5 g

Sodium Chloride	5 g

Dipotassium Phosphate	2.5 g

Agar	15 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 7.3±0.2로 조정 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

나. 증균배양

농산물 및 농자재에 대해서는 증균배지로 Listeria 증균배지(배지 1)를 사용하며, 검체 25 g(mL)를 취하여 225 mL의 Listeria 증균배지를 가한 후 30℃에서 24∼48시간 배양한다. 이후, 배양액 0.1 ml을 10ml의 Fraser broth에 접종하여 35∼37℃에서 24∼48시간 2차 증균을 실시한다.

다. 분리배양

증균배양액을 Oxford 한천배지(배지 2) 또는 PALCAM 한천배지(배지 3)에 접종하여 35〜37℃에서 24∼48시간 배양한다. 의심집락이 확인되면 이를 0.6% yeast extract가 포함된 Tryptic soy 한천배지(배지 4)에 접종하여 30℃에서 24∼48시간 배양한다.

라. 확인시험

그람염색 후 그람양성 간균이 확인되면 hemolysis, motility, catalase, CAMP test와 mannitol, rhamnose, xylose의 당분해시험을 실시한다. 이 결과 β-hemolysis를 나타내고 catalase 양성, motility 양성을 나타내며 CAMP test결과 Staphylococcus aureus(ATCC 25923)에서 양성, Rhodococcus equi(ATCC 6939)에서 음성으로 나타나는 동시에 당분해시험 결과 mannitol 비분해, rhamnose 분해, xylose 비분해의 결과를 보일 경우 Listeria monocytogenes 양성으로 판정한다.

또한 확인시험시 각종 생화학시험은 국제적으로 공인된 키트(kit) 또는 장비를 이용할 수 있다. 필요한 경우 혈청형 확인시험, 독소 유전자 확인시험, 유전체 상동성 분석시험을 추가할 수 있다.

Ⅳ.기타성분

1.〜2. (생략)

Ⅳ.기타성분

1.〜2. (현행과 같음)

3. 염소와 염분(염화물)

가. (생략)

나. <신 설>

3. 염소와 염분(염화물)

가. (현행과 같음)

나. Ion chromatography 법

1) 적용범위

이 분석법은 이온크로마토그래프(IC)를 이용하여 부산물비료 중의 염소를 0.2μm 막여과지에 통과시켜 고체 미립자를 제거한 후 음이온 교환 컬럼을 통과시켜 전기전도도 검출기로 정량 분석 하는데 적용 한다.

2) 분석기기 및 기구

가) 검출기 : 전기전도도 검출기, 전기화학적 검출기 등

나) 분리컬럼 : 유리 또는 에폭시 수지로 이온교환체를 충진시킨 것

다) 펌프 : 150kg/cm2 ∼ 350kg/cm2 고압 압력 펌프

3) 시약의 조제

가) 표준원액: IC용 1,000mg/L: Cl-을 포함한 음이온 표준액

나) 용리액(Eluant) : 3.2mM Na2CO3 + 1mM NaHCO3 / 1L H2O

다) Suppressor Regenerant Reagent :　98% 이상의 H2SO4 용액을 3mL 정확히 취하여 1L에 정제수를 넣어 표선을 채운다.

라) 탈이온수 (이온교환수지로 탈염 정제한 물)

4) 공시액 조제

가) 공시품 일정량을 250mL 용량플라스크에 정확히 취하고 150mL 물을 가하여 수평진탕기(100회/분, 진폭 10cm 또는 190회/분, 진폭 5 cm)를 사용하여 30분간 진탕한 다음 거름종이 5B 또는 이와 동등한 여지를 사용하여 여과한다.

나) 여액을 0.45㎛ 이하의syringe filter 를 사용하여 10mL vial 에 옮겨 담는다.

5) 정량

가) 검량선의 작성

(1) 탈이온수에 염소이온 표준원액 (1,000mg/L) 0.1mL, 0.2mL, 0.5mL, 1.0mL,  2.0mL를 정확히 취하여 100mL 용량플라스크에 넣고 물을 넣어 표선을 채워 다음과 같이 준비한다.

검량선	표준물질	표준물질 주입량	최종농도
STD.1	1,000 mg/L	0.1 mL	1.0 mg/L
STD.2	1,000 mg/L	0.2 mL	2.0 mg/L
STD.3	1,000 mg/L	0.5 mL	5.0 mg/L
STD.4	1,000 mg/L	1.0 mL	10.0 mg/L
STD.5	1,000 mg/L	2.0 mL	20.0 mg/L

(2) 이온크로마토그래프룰 작동시켜 유속을 0.7 mL/min 압력은 6～8MP, 전기전도도는 1~5uS/cm 으로 고정시킨 다음 용리액 및 재생액을 흘러 보내면서 펌프의 압력 및 검출기의 전도도가 일정하게 유지될 때까지 기다린다.

(3) 기기가 안정화되면 각각의 검량선 작성용 표준액을 주입하여 크로마토그램을 작성하고 각 음이온의 농도와 크로마토그램상의 봉우리높이 또는 면적에 대한 검량선을 작성한다.

나) 시료분석

검량선 작성 시와 같은 기기조건하에서 이온크로마토그래프에 주입하여 크로마토그램을 측정하고 미리 작성한 검량선으로부터 시료의 농도(mg/L)를 산출하며 정도보증 및 정도관리는 표1에 따른다.

(부 기)

용리액의 조성 및 농도는 기기제조 회사 또는 분리 컬럼의 종류 등에 따라 달라질 수 있으므로 사용기기에 대한 설명서를 참조한다.

표1. 정도관리 목표 값

정도관리 항목	정도관리 목표
정량한계 검정곡선 정밀도 정확도	0.1 mg/L 결정계수(R2) 0.98 이상 또는 감응계수(RF)의 상대표준편차 ≤ 20 % 상대표준편차가 ± 25 % 이내 75 ∼ 125 %

4.〜19. (생략)

4.〜19. (현행과 같음)

20. <신 설>

20. 이물질

가. 이물질: 유리, 플라스틱, 금속, 뼈, 도자기, 타일, 비닐, 천, 은박, 종이 등 이와 유사한 물질

나. 검사방법

1) 비료 약 100g 이상을 잘 혼합한 후 펼쳐서 60℃(±1℃)에서 약 24시간 건조시킨 후 비료의 무게를 측정한다(A).

2) 건조된 비료에서 2mm를 초과하는 이물질을 125mm～2mm의 표준체를 사용하여 선별한다.

※ 비료 중 응집되어 있는 덩어리는 2mm 표준체에서 흐르는 물로 씻어 주면서 부드러운 솔로 약 5분간 가볍게 쓸어서 풀어준다. 다만, 선별과정 또는 덩어리를 푸는 과정에서 이물질이 파쇄가 되지 않아야 한다.

※ 표준체는 별표1. Ⅱ. 주성분. 5. 분말도측정법의 시험용 체의 규격표에 있는 것을 말한다.

3) 선별한 이물질을 물로 세척한 후 60℃(±1℃)에서 약 24시간 건조시킨 후 이물질의 무게를 측정한다(B)

다. 계산방법

이물질 (%) =	건조 후 이물질무게(B)	×100
	건조 후 비료무게(A)

라. 판정기준

「비료 공정규격설정 및 지정」(농진청 고시) 제6조제1항제9호에 따른다.